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La culture in vitro des plantes est une technique de multiplication végétative sous conditions aseptiques et contrôlées, utilisant des explants (parties de plante) placés sur des milieux nutritifs artificiels. Appartenant au domaine de la biotechnologie végétale, cette méthode repose sur la totipotence des cellules végétales, c’est-à-dire leur capacité à régénérer une plante entière.

Dans un contexte de sécurité alimentaire, de changements climatiques et de recherche de variétés performantes, la culture in vitro s’impose comme une solution innovante. Ceci notamment pour des espèces d’intérêt économique comme le piment (Capsicum spp.). Cette plante, largement cultivée en Afrique, Asie et Amérique latine, est confrontée à de nombreuses contraintes de production : maladies, faible productivité, accès limité à des semences certifiées, etc[1]

1. Pourquoi la culture in vitro du piment ?

La culture in vitro du piment présente un intérêt majeur pour surmonter les limites de la production traditionnelle. Notamment la faible disponibilité de semences certifiées, la variabilité génétique incontrôlée et la propagation de maladies. Par ailleurs, elle permet une multiplication rapide et à grande échelle de plantes génétiquement identiques, saines et vigoureuses, tout en garantissant l’élimination de pathogènes transmis par les semences ou le sol, comme Ralstonia solanacearum.

Cette technique facilite également la conservation du matériel génétique (germoplasme). En outre, elle facilite aussi la création de nouvelles variétés résistantes par sélection assistée ou transformation génétique d’une part. D’autre part la production ciblée de composés d’intérêt (capsaïcine, antioxydants).

Elle constitue donc un levier stratégique pour renforcer la qualité, la productivité et la durabilité des filières pimentières.

a) Multiplication rapide de matériel végétal sélectionné.

Contrairement à la multiplication par semences, qui peut introduire de la variabilité génétique, la micropropagation permet d’obtenir en peu de temps un grand nombre de plantes génétiquement identiques au pied mère.

b) Production de plants sains et indemnes de pathogènes.

La culture in vitro permet d’éliminer les agents pathogènes souvent transmis par les semences ou le sol (comme Ralstonia solanacearum ou Phytophthora capsici).

c) Conservation du germoplasme.

Elle facilite la conservation de variétés locales ou patrimoniales, en particulier dans les banques de gènes végétales, par cryoconservation ou cultures lentes.

d) Support à la sélection et à la recherche.

Grâce à cette technique, il est possible de [2]:

• Créer de la variabilité génétique contrôlée (mutagenèse, culture d’anthères),
• Réaliser la transformation génétique (gènes de résistance, tolérance au stress),
• Étudier la réponse des tissus à différents stress abiotiques ou biotiques.

2- Techniques de culture in vitro.

Deux principales méthodes de culture in vitro sont connues et les plus utilisées dans le monde sont : l’organogenèse et l’embryogenèse somatique (Sedra, 2003 ; Anjarne et al.,2005).

1. Organogénèse

La technique d’organogenèse exploite les potentialités méristématiques des bases des jeunes feuilles du cœur de rejet à donner naissance à des bourgeons végétatifs aptes à se multiplier.  Il faut noter que l’origine préexistant de ces bourgeons confère à cette technique un niveau élevé de conformité génétique des vitro plants produits (Aissam, 1990).

L’obtention de plantules via cette technique suppose l’initiation des bourgeons pour non seulement l’établissement des souches réactives. Mais aussi leur multiplication, élongation, enracinement et l’acclimatation des plantules (Anjarne et al.,2005).

2. Embryogenèse somatique

L’embryogenèse somatique (encore appelée embryogenèse asexuée) désigne la formation in vitro d’embryons à partir d’une ou de plusieurs cellules somatiques ou germinales, sans fusion gamétique. Les embryons somatiques produits sont, en principe, génétiquement identiques et capables de produire des clones à partir de génotypes donnés (El Hadrami, 1998).

Egalement disponible: Généralités sur la culture de piment

3. Matériaux de départ : les explants.

Les explants les plus utilisés dans la culture in vitro du piment sont [3]:

• Les cotylédons (issus de jeunes plantules),
• Les segments de tiges ou bourgeons axillaires,
• Les feuilles (pour la régénération indirecte par callogenèse),
• Les anthères (pour produire des haploïdes dans les programmes d’hybridation).

4. Milieux de culture et régulateurs de croissance.

Le milieu Murashige & Skoog (MS) est la base la plus fréquemment utilisée, enrichie en saccharose (source de carbone) et gélifiée à l’agar.[4]

Les régulateurs de croissance sont essentiels pour orienter le développement :

• Cytokinines : BAP (6-benzylaminopurine), Kinetine → favorisent la multiplication des bourgeons.
• Auxines : NAA (acide naphtalèneacétique), IAA, IBA, 2,4-D → favorisent l’enracinement ou la callogenèse.

👉 La combinaison et les concentrations de ces hormones dépendent de l’objectif : régénération directe, callogenèse, enracinement, etc.

5. Protocole général simplifié.

1. Préparation des explants : semis de graines en conditions stériles pour obtenir des plantules.
2. Stérilisation : les explants sont désinfectés (eau de Javel diluée, éthanol) puis rincés à l’eau stérile.
3. Mise en culture : placement sur milieu de pré-culture, puis de multiplication.
4. Régénération : formation de bourgeons ou de callus selon le protocole.
5. Enracinement : transfert sur milieu favorisant la racine.
6. Acclimatation : repiquage progressif en serre ou pépinière, en conditions semi-contrôlées.

6. Défis spécifiques Capsicum spp.

Le piment est réputé comme recalcitrant à la régénération dans certaines conditions. Les problèmes courants sont :

• Faible taux de réponse des explants, surtout pour les génotypes sauvages.
• Hyperhydricité (vitrification) : excès d’humidité qui rend les tissus translucides et cassants.
• Contamination microbienne, notamment fongique, difficile à éradiquer sans endommager les tissus.
• Nécrose des tissus, surtout lors de longues expositions aux auxines.

Des ajustements doivent donc être faits selon[4] :

• L’origine génétique de la plante,
• L’âge des explants,
• Le type de régulateur utilisé,
• Les conditions de lumière, température et pH.

 

7. Avantages de la culture in vitro.

1. Collection de génotypes et état physiologique du matériel conservé.

A partir d’un matériel sélectionné en forêt, en verger ou en pépinière, il est possible de produire par culture de nœuds et/ou micro propagation des copies végétatives qui serviront à l’installation de parcs à pied-mères.

Grâce à la culture d’embryons zymotiques, à la micro propagation et à l’embryogenèse somatique, des génotypes peuvent être conservés in vitro (tubes, bocaux ou boites de pétri) sur de longues périodes pouvant dépasser les 10 ans (cas de l’orme, du noyer, des porte- greffes fruitiers…). (Seelye et al., 2003).

Cette technique demande d’importants moyens humains pour entretenir les souches in vitro tout au long de l’année sur la base de repiquages mensuels. Cependant, on peut envisager de conserver les génotypes clonés dans l’azote liquide par cryoconservation (Engelmann et Baubault, 1986) de méristèmes (cas du merisier et du noyer), d’embryons somatiques (cas du mélèze) et zygotiques (cas du palmier à huile). Enfin, l’application des techniques de culture in vitro (Micropropagation et microgreffage) permet de maintenir le matériel sélectionné dans un état proche de la juvénilité favorable à la multiplication végétative, au bouturage en particulier (Franclet, 1980).

2. Obtention de matériels indemnes de maladies.

Grâce à la culture de méristèmes ou à la technique de microgreffage on peut produire des variétés indemnes de virus en particulier (cas du fraisier, de la pomme de terre, de la vigne et des porte-greffes fruitiers) et éviter ainsi des pertes de productivité voire même la dégénérescence des plants cultivés. Ces variétés peuvent être conservées soit en culture in vitro soit en pépinière. Un suivi de ces variétés peut être effectué grâce à des tests sérologiques attestant la qualité de l’état sanitaire des plants commercialisés. (Fki et al., 2010).

3. Développement de méthodes de production de plants

La culture in vitro a depuis longtemps fait ses preuves comme outil de production de plants par sa rapidité à amplifier une variété donnée, par sa capacité à raccourcir les cycles de production et à stocker de grandes quantités de matériel dans un espace réduit, par sa puissance de production en masse sur des temps courts permettant une programmation précise de la sortie des plants commandés.

Dans le domaine de l’horticulture, deux principales méthodes sont aujourd’hui utilisées : la micro-propagation et l’embryogenèse somatique.

La première est bien adaptée à la production de plantes herbacées, d’arbres fruitiers et de feuillus forestiers, alors que la seconde est performante pour les conifères et certaines monocotylédones telles que le palmier dattier par exemple (Jay-Allemand et al., 1992).

4. Culture in vitro au service de l’amélioration variétale.

L’amélioration génétique traditionnelle tient et tiendra encore toute sa place pour les années à venir afin de sélectionner des variétés bien adaptées à l’environnement dans lequel elles seront cultivées, tolérantes aux maladies et possédant des caractéristiques agronomiques intéressantes.

Cependant, là encore la culture in vitro joue et jouera un rôle déterminant à trois principaux niveaux :

La sauvegarde de génotypes produits par fécondation contrôlée grâce à la culture d’embryons zygotiques ou d’axes embryonnaires.

La production d’haploïdes par androgenèse (culture d’anthères) ou gynogenèse (sacs embryonnaires, oosphères non fécondés) permettant d’obtenir des lignées homozygotes après diploïdisation, recherchées par les améliorateurs.

La production de plants génétiquement modifiés via Agro bacterium-tumefaciens par l’utilisation de techniques de régénération faisant appel à l’embryogenèse somatique au bourgeonnement adventif et à la micro-propagation. (Jay-Allemand et al., 1992).

 

8. Inconvénients liés à la culture in vitro.

1. Vitrification

Certains accidents, non prévisibles au départ, peuvent intervenir en cours de culture in vitro. On a par exemple des malformations dues à un déséquilibre hormonal. (Fki et al., 2010).

2. Perte de caractères intéressants.

La production répétée de grands nombres de plants uniformes (clones) peut entraîner la perte des gènes nécessaires, par exemple, à la résistance aux maladies nouvelles, il faut donc conserver les pieds mères et à certains moments, repasser par la reproduction sexuée. (Fki et al., 2010).

3. Problèmes inhérents à la technique. 

a. Asepsie

La technique de culture in vitro exige beaucoup de soin pour le maintien des cultures en condition d’asepsie. Lorsque l’on a des cultures infectées, cela peut provenir de différentes causes. Il peut s’agir d’un champignon (moisissure) ou d’une bactérie. S’il s’agit d’un champignon, on voit un développement mycélien qui a une texture feutrée, souvent blanche ou grisâtre. S’il s’agit d’une bactérie, on voit alors un voile d’aspect laiteux, développé à l’intérieur du milieu et à la surface.

Si l’infection part de la zone de contact entre les tissus et le milieu, ce sont les tissus eux-mêmes qui sont la source de l’infection. Si l’infection part d’un point quelconque du milieu, la source de l’infection peut être soit l’air, soit une mauvaise stérilisation du milieu, soit une infection de l’air ambiant par l’intermédiaire de l’eau de condensation au niveau du couvercle (Auger et al., 1989).

b. Acclimatation.

Le passage à des conditions de culture normale est parfois délicat. En effet, durant son séjour in vitro, la plante est à l’abri des stress. (Auger et al., 1989).

c. Apparition d’anomalies génétiques.

Certains cas d’hyper floraison, perte de sexualité chez certaines espèces, apparition d’organes anormaux : c’est la variation soma clonale. (Auger et al., 1989).

d. Contamination.

La technique de culture in vitro exige beaucoup de soin pour le maintien des cultures en condition d’asepsie. Lorsque l’on a des cultures infectées, cela peut provenir de différentes causes. Il peut s’agir d’un champignon (moisissure) ou d’une bactérie.

S’il s’agit d’un champignon, on voit un développement mycélien qui a une texture feutrée, souvent blanche ou grisâtre. S’il s’agit d’une bactérie, on voit alors un voile d’aspect laiteux, développé à l’intérieur du milieu et à la surface. Il faut noter que si l’infection part d’un point quelconque du milieu ; la source de l’infection peut être soit l’air, soit une mauvaise stérilisation du milieu. Mais aussi, soit une infection de l’air ambiant par l’intermédiaire de l’eau de condensation au niveau du couvercle (Auger et al., 1989).

Conclusion.

La culture in vitro du piment est un outil biotechnologique puissant qui peut transformer les modes de multiplication et d’amélioration de cette plante stratégique. Malgré certains défis techniques, les progrès récents permettent d’envisager une adoption plus large, notamment dans les pays en développement. Elle représente une solution durable pour produire des plants sains, accélérer les programmes de sélection et répondre aux enjeux de sécurité alimentaire et nutritionnelle.

 

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Références scientifiques.

[1] Bhutia, N., et al. (2018). Micropropagation of chilli (Capsicum annuum L.) for virus-free planting material production. Scientia Horticulturae, 236, 187-194.

[2] Teixeira da Silva, J.A. (2012). Capsicum biotechnology: tissue culture and molecular biology perspectives. Plant Cell Reports, 31(5), 761–776.

[3] Geetha, S., & Padmaja, G. (2016). In vitro regeneration and transformation studies in Capsicum spp. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 126, 377–388.

[4] Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15(3), 473–497.